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龍圖騰網獲悉上海藥明生物醫藥有限公司申請的專利通過優化提高Bxb1酶的重組效率的方法獲國家發明授權專利權，本發明授權專利權由國家知識產權局授予，授權公告號為：CN116004586B 。

龍圖騰網通過國家知識產權局官網在2025-08-26發布的發明授權授權公告中獲悉：該發明授權的專利申請號/專利號為：202211533245.1，技術領域涉及：C12N9/50；該發明授權通過優化提高Bxb1酶的重組效率的方法是由周曉元;秦毅;王卓智;顧繼杰設計研發完成，并于2022-12-01向國家知識產權局提交的專利申請。

本通過優化提高Bxb1酶的重組效率的方法在說明書摘要公布了：本發明公開了一種通過優化提高Bxb1酶的重組效率的方法，至少包括以下步驟：1基于Bxb1酶結構，挑選出影響Bxb1酶活性的突變位點；2對步驟1中挑選出來的突變位點進行定向突變獲得不同的Bxb1酶突變體；3宿主細胞中建立熒光assay,對步驟2中不同的Bxb1酶突變體的重組效率進行評估。本發明通過定向突變和熒光assay評估的方式，成功獲得了三個Bxb1酶的突變體，分別是Bxb1L82W，Bxb1D13R，Bxb1T15R。這三個Bxb1酶突變體與Bxb1酶野生型相比，介導的細胞系重組效率均有所提高。

本發明授權通過優化提高Bxb1酶的重組效率的方法在權利要求書中公布了：1.一種通過優化提高Bxb1酶的重組效率的方法，其特征在于，至少包括以下步驟： 1基于Bxb1酶結構，挑選出影響Bxb1酶活性的突變位點，所述突變位點為Bxb1D13R或Bxb1L82W； 2對步驟1中挑選出來的突變位點進行定向突變獲得不同的Bxb1酶突變體，獲得不同的Bxb1酶突變體的方法是：設計兩條重疊引物，對野生型Bxb1酶的質粒進行環形PCR，得到Bxb1酶突變體質粒，并通過測序的方式來驗證是否成功引入相應突變； 其中，所述野生型Bxb1酶的質粒的序列為SEQIDNO:1所示，兩條重疊引物的序列為SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，Bxb1酶D13R突變體質粒為SEQIDNO.4所示，供體質粒為SEQIDNO.5所示，Bxb1酶L82W突變體質粒為SEQIDNO.6所示； 3宿主細胞中建立熒光assay,對步驟2中不同的Bxb1酶突變體的重組效率進行評估，所述宿主細胞是CHO-S.ATTP-GFP.A12，CHO-S.ATTP-GFP.A12宿主細胞中有一個CMV啟動子，attP重組位點，后面是GFP基因和PolyA，所述CHO-S.ATTP-GFP.A12宿主細胞能表達GFP綠色熒光蛋白基因而發綠光； 所述評估的方法是： 在所述宿主細胞中共轉兩個質粒，一個是Bxb1酶突變體質粒，另一個是供體質粒； 所述供體質粒的attB重組位點后是RFP紅色熒光蛋白基因和polyA，然后是一個完整的BFP藍色熒光蛋白基因表達框； 一起電轉后，轉染了的所述宿主細胞會表達所述BFP基因而發藍光； 而只有成功重組的所述宿主細胞才會因為所述RFP基因前面有了啟動子導致所述RFP基因得以正常表達而發紅光； 重組效率％＝紅色熒光細胞的比例藍色熒光細胞的比例*100％。

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