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龍圖騰網獲悉博雅干細胞科技有限公司申請的專利羊膜間充質干細胞源外泌體及其用途獲國家發明授權專利權，本發明授權專利權由國家知識產權局授予，授權公告號為：CN115475181B 。

龍圖騰網通過國家知識產權局官網在2025-09-23發布的發明授權授權公告中獲悉：該發明授權的專利申請號/專利號為：202211289924.9，技術領域涉及：C12N5/0775；該發明授權羊膜間充質干細胞源外泌體及其用途是由魏卿;肖海蓉;劉慶喜設計研發完成，并于2022-10-21向國家知識產權局提交的專利申請。

本羊膜間充質干細胞源外泌體及其用途在說明書摘要公布了：本發明涉及羊膜間充質干細胞源外泌體及其用途。一方面，本發明涉及從羊膜間充質干細胞分離提取的外泌體在制備用于治療炎性疾病的藥物中的用途，所述外泌體具有50～200nm的平均粒徑，外泌體膜蛋白CD9的陽性表達率大于70％，膜蛋白CD81的陽性表達率大于80％。本發明的外泌體是使用羊膜間充質干細胞經IL?1β處理后在低氧分壓條件下培養得到的。還涉及使用外泌體調控外周血單個核細胞PBMC分泌TNF?α水平的方法，以及使用羊膜間充質干細胞分離提取的外泌體和其制法。本發明外泌體具有生物調控性能。

本發明授權羊膜間充質干細胞源外泌體及其用途在權利要求書中公布了：1.使用羊膜間充質干細胞分離提取外泌體的方法，該方法包括如下步驟： 1將P3~P8代的羊膜間充質干細胞接種至T75培養瓶中，每瓶接種2~10×105個細胞，添加MSC完全培養基10~20ml，置37℃、5%CO2培養箱中培養20~30小時使細胞貼壁，再向培養液中添加IL-1β至濃度8~12ngmL、酒石酸鈉0.125~0.175mgmL、鹽酸賴氨酸2.0~2.5mgmL，繼續培養20~30小時；所述羊膜間充質干細胞是通過包括如下步驟的方法制備得到的： a從胎盤樣品采集盒中取出胎盤，置于白瓷盤中，使用基礎平衡鹽溶液反復沖洗表面，對胎盤進行消毒處理；所述基礎平衡鹽溶液是通過如下方式配制得到的：將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4·12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液； b用手術鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基礎平衡鹽溶液反復清洗表面污血，剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊；用300目濾網過濾，生理鹽水沖洗殘血，組織塊轉移至50ml離心管； c組織消化：在37℃恒溫搖床中，將組織塊用1倍組織體積的混合酶消化液以100rpm振蕩消化30~60min；消化結束后，加2ml胎牛血清混勻終止；用200目濾網過濾并用大量生理鹽水清洗，收集濾液；所述混合酶消化液的組成為：0.1mgml的I型膠原酶，0.3mgml的II型膠原酶，0.1mgml的透明質酸酶和0.05mgml的中性蛋白酶； d分別對濾液部分和組織塊部分進行細胞培養： 濾液部分：收集的濾液以1500rpm離心5min，去上清，用生理鹽水重懸清洗細胞沉淀；以1500rpm離心5min，去上清，將細胞沉淀用完全培養基重懸；計數儀計取有核細胞數并用臺盼蘭染色測定細胞活率；以每瓶2×106個細胞接種于75cm2培養瓶中，添加20ml完全培養基，晃勻后在5%CO2、37℃培養箱中培養；定期換液；培養10~15天后傳代至P1代，繼續用完全培養基培養；所述完全培養基包括：DMEM-F12培養基、10%FBS、100μgmL青霉素、50μgmL鏈霉素、0.01~0.05%硝酸硫胺、0.05~0.1%麥芽糖，所述DMEM-F12培養基是DMEM-F12以體積比1：1配制的培養基； 組織塊部分：將收集的組織塊置于75cm2培養瓶中，使組織塊能夠覆蓋培養瓶中一半的培養面積，添加完全培養基沒過組織，晃勻后于5%CO2、37℃培養箱中培養；2天后補液10ml完全培養基，繼續培養；較多間充質干細胞爬出后去組織，定期換液；培養10~15天后傳代至P1代，繼續用完全培養基培養； eP1代細胞收獲：用胰酶消化液將上一步驟中的兩部分合并后的P1代細胞消化后，收集細胞，計數并測定細胞活率，凍存，即得P1代的羊膜間充質干細胞；所述胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液； f純化培養和傳代：以5000~15000個cm2的接種密度將羊膜P1代細胞接種于T75培養瓶中用完全培養基培養，第3-4天全換液；繼續培養至第11天，用胰酶消化液消化細胞，用完全培養基終止消化，1400rpm離心5分鐘，收集沉淀即為P2代羊膜間充質干細胞；所述胰酶消化液是包含0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液； gP2代細胞再以步驟f的方式純化培養和傳代，得P3代細胞；以此類推，依次得到P3~P8代間充質干細胞； 2吸棄培養基，更換為新鮮的MSC完全培養基，使細胞繼續于37℃、5%CO2培養箱中培養直至細胞融合度≥80%； 3吸棄培養基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培養基，再置于37℃、2%O2、5%CO2培養箱中培養42~56小時； 4吸取細胞上清液置離心管中，進行如下離心處理：以250~350g、4℃離心8~12分鐘，吸取上清液至另一離心管中；以1500~2500g、4℃離心18~25分鐘，吸取上清液至另一離心管中；以8000~12000g、4℃離心25~35分鐘，上清液用0.22μm濾膜過濾后置于另一離心管中；以80000~120000g、4℃離心75~120分鐘，棄上清； 5向離心管中添加無菌PBS使外泌體沉淀重懸，以80000~120000g、4℃離心75~120分鐘，棄上清液，加無菌PBS使外泌體重懸，得到呈懸液形式的外泌體；所得外泌體表達了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81，膜蛋白CD9的陽性表達率大于70%，膜蛋白CD81的陽性表達率大于80%。

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