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龍圖騰網(wǎng)獲悉中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院申請(qǐng)的專利腫瘤細(xì)胞特有修飾多肽/蛋白的制備方法、抗體及腫瘤診療方法獲國(guó)家發(fā)明授權(quán)專利權(quán)，本發(fā)明授權(quán)專利權(quán)由國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局授予，授權(quán)公告號(hào)為：CN115508489B 。

龍圖騰網(wǎng)通過國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局官網(wǎng)在2025-09-09發(fā)布的發(fā)明授權(quán)授權(quán)公告中獲悉：該發(fā)明授權(quán)的專利申請(qǐng)?zhí)?專利號(hào)為：202211320874.6，技術(shù)領(lǐng)域涉及：G01N30/08；該發(fā)明授權(quán)腫瘤細(xì)胞特有修飾多肽/蛋白的制備方法、抗體及腫瘤診療方法是由郭維英設(shè)計(jì)研發(fā)完成，并于2022-10-26向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交的專利申請(qǐng)。

本腫瘤細(xì)胞特有修飾多肽/蛋白的制備方法、抗體及腫瘤診療方法在說明書摘要公布了：本申請(qǐng)公開了一種腫瘤細(xì)胞特有修飾多肽蛋白的制備方法、抗體及腫瘤診療方法，通過從腫瘤組織細(xì)胞中制備得到細(xì)胞膜蛋白，質(zhì)譜明確修飾位點(diǎn)，修飾分子結(jié)構(gòu)，鑒定被修飾的多肽蛋白質(zhì)。通過對(duì)發(fā)生新修飾的目的蛋白或者多肽進(jìn)行制備，并利用該目的蛋白或者多肽制備診斷腫瘤的抗體以及用于制備治療腫瘤的抗體。進(jìn)行查庫(kù)時(shí)，根據(jù)多肽蛋白的氨基酸位點(diǎn)、連接的分子位點(diǎn)、修飾基團(tuán)不同，查出被修飾的多肽及蛋白質(zhì)，利用該修飾后蛋白功能可以解釋腫瘤的生物學(xué)行為。有了被修飾的多肽及蛋白質(zhì)的清晰結(jié)構(gòu)，就可以制備抗體。制備抗體后可以用于腫瘤診斷，人源化的抗體可因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)消滅腫瘤細(xì)胞，也可攜帶細(xì)胞毒藥物，定向殺滅腫瘤。

本發(fā)明授權(quán)腫瘤細(xì)胞特有修飾多肽/蛋白的制備方法、抗體及腫瘤診療方法在權(quán)利要求書中公布了：1.一種腫瘤細(xì)胞特有修飾多肽或蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 從腫瘤組織中提取得到細(xì)胞膜蛋白質(zhì)； 采用蛋白質(zhì)酶解法，對(duì)所述細(xì)胞膜蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，獲取目的多肽，包括： 將二硫蘇糖醇DTT液加入上述蛋白質(zhì)溶液樣品試管中，得到DTT最終濃度為100mM的溶液，將試管置于沸水浴反應(yīng)5min，然后放置于試管架逐漸冷卻至室溫； 在上述溶液加入200μLUAbuffer液混勻，轉(zhuǎn)入到10kD超濾離心管中，高速離心，棄濾液，重復(fù)該步驟，取上清液； 加入100μL50mmollIAAbuffer，600rpm振蕩1min，室溫下避光反應(yīng)30min，高速離心，再次加入100μLUAbuffer離心，重復(fù)該步驟兩次； 加入100μL25mMNH4HCO3溶液，離心，重復(fù)該步驟兩次； 加入40μLTrypsinbuffer，600rpm振蕩1min，37℃靜置16-18h； 更換新收集管，離心；加入40μL25mMNH4HCO3，離心14000*g15min，收集濾液；其中，所述濾液中包含目的多肽； 對(duì)所述目的多肽采用強(qiáng)陰離子交換層析方法進(jìn)行富集，得到富集后的目的多肽，包括：配制洗脫緩沖液A、洗脫緩沖液B、20%乙醇及1MNaOH，其中：洗脫緩沖液A為0.05MTris-HCl，pH=8.5；洗脫緩沖液B為0.5MNaCl，0.05MTris-HCl，pH=8.5；分別對(duì)洗脫緩沖液、20%乙醇、1MNaOH及去離子水用0.45μm濾膜進(jìn)行抽濾以除去少量雜質(zhì)；將上述抽濾除雜的溶液置于4℃?zhèn)溆茫磺逑碅KTA蛋白快速純化系統(tǒng)，連接AKTA、CaptoHiResQ550預(yù)裝柱、紫外檢測(cè)器和收集裝置，并檢查氣密性；將冷柜溫度調(diào)至4℃，先后接入去離子水和洗脫緩沖液，分別平衡至檢測(cè)器曲線不再變化，調(diào)節(jié)流速0.2mLmin；將上述酶解后收集到的濾液用洗脫緩沖液充分溶解，用0.45μm的一次性注射用濾器過濾去除不溶物，接入AKTA蛋白快速純化系統(tǒng)進(jìn)行上樣；上樣完畢后接入洗脫緩沖液A，洗出未被吸附的蛋白，待流穿峰完全洗出后，用洗脫緩沖液A和洗脫緩沖液B進(jìn)行梯度洗脫，并分別收集各個(gè)洗脫峰；收集多肽峰從3mAU起始收集，并于-80度冷凍保存；酶解后產(chǎn)生多肽在PH8.5左右的溶液中，其多肽上的N端氨基和肽中任何組氨酸都不是質(zhì)子化，而是以中性形式存在，而肽中Asp，Glu和酪氨酸殘基均為陰離子，賴氨酸被部分質(zhì)子化，精氨酸被完全質(zhì)子化，在這個(gè)PH，富含Asp，Glu和酪氨酸殘基的多肽容易通過離子交換保留；所以選擇膜蛋白酶解后進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換層析，能夠富集含-COOH的多肽；目的多肽的氨基酸側(cè)鏈修飾，末端含有-COOH，在PH8.5的溶液中為陰離子； 對(duì)富集后的目的多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析、鑒定，明確有無(wú)目的修飾基團(tuán)； 根據(jù)修飾類型及修飾位點(diǎn)，并經(jīng)過PD查庫(kù)，明確該修飾基因的序列，得到所述腫瘤細(xì)胞特有修飾多肽或蛋白：可變修飾OxidationM，AcetylProteinN-term：修飾的分子量72，氨基酸為絲氨酸及蘇氨酸側(cè)鏈羥基上連C3H5O2；一級(jí)離子質(zhì)量容差：±20ppm；二級(jí)離子質(zhì)量容差：0.1Da。

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