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龍圖騰網獲悉賽業(蘇州)生物科技有限公司;廣州賽業百沐生物科技有限公司申請的專利一種構建人源化DEB小鼠模型的方法獲國家發明授權專利權，本發明授權專利權由國家知識產權局授予，授權公告號為：CN118421700B 。

龍圖騰網通過國家知識產權局官網在2025-09-09發布的發明授權授權公告中獲悉：該發明授權的專利申請號/專利號為：202410508521.1，技術領域涉及：C12N15/85；該發明授權一種構建人源化DEB小鼠模型的方法是由牟星;徐婧語設計研發完成，并于2024-04-26向國家知識產權局提交的專利申請。

本一種構建人源化DEB小鼠模型的方法在說明書摘要公布了：本發明屬于動物基因工程和基因遺傳修飾領域，具體地說，公開了一種構建人源化大皰性表皮松解癥DEB小鼠模型的方法，及其在生物醫藥的應用。所述方法包括以下步驟：使用小鼠ES胚胎干細胞制備基因工程小鼠，并以人COL7A1基因組序列或其突變序列替換小鼠全長Col7a1基因序列；優選的，所述人COL7A1基因組序列如hg19:chr3:48,635,720?48,603,572所示；所述人COL7A1基因組突變序列如hg19:chr3:48,635,720?48,603,572c.6527dupC所示；本發明構建的突變型動物可以存活7?10d，與已報道敲除小鼠Col7a1??中位生存期存活2d相比，可在不用藥物維持的基礎上顯著增加生存期，給治療實驗提供了更長的窗口期。

本發明授權一種構建人源化DEB小鼠模型的方法在權利要求書中公布了：1.一種構建人源化DEB小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步驟： （1）構建打靶載體I，打靶載體包含5arm同源臂序列、Puro抗性篩選元件、1.9KbKI序列及3arm同源臂序列； 所述1.9KbKI序列包括部份人114號內含子序列、115號外顯子到3’UTR的所有基因組序列，所述1.9KbKI序列通過基因合成獲取； 所述1.9KbKI序列如SEQIDNo.6所示； 所述Puro兩側分別帶有一個lox2272和loxP元件； 所述同源臂序列從C57BL6小鼠的基因組中進行擴增獲取； （2）構建打靶Bac載體II，人COL7A1基因上游3kb處插入與打靶載體I同向的lox2272重組酶位點，在人COL7A1基因114號內含子中插入與打靶載體I同向的loxP重組酶位點；且人COL7A1基因與loxP之間包含一個Neo抗性篩選元件，Neo兩側帶有Rox序列,其中BAC是RP11-118J3； 所述插入人源基因組序列為hg19:chr3:48,635,720-48,603,572； （3）將構建好的打靶載體I電轉到C57BL6品系的ES細胞中，細胞經過Puromycin藥物篩選，挑取藥物抗性的ES克隆，相關ES克隆進行培養、擴增后進行PCR分型鑒定及Southern鑒定，獲得正確打靶的陽性ES細胞I； （4）將構建好的Bac載體II電轉到ES細胞I中，細胞經過G418藥物篩選，挑取藥物抗性的ES克隆，相關ES克隆進行培養、擴增后進行PCR分型鑒定及Southern鑒定，獲得正確打靶的陽性ES細胞II； （5）將陽性ES細胞II注射入囊胚中，再將囊胚移植到代孕鼠內，通過20天左右的孕期，小鼠出生； （6）剪取5-7d的幼鼠鼠爪，提取DNA，進行PCR分型鑒定確認小鼠基因型； （7）待雄性Founder小鼠到8周齡與野生型異性小鼠交配獲得F1代雜合子小鼠，小鼠出生7天后PCR鑒定，若有陽性小鼠出生，則表示轉基因已經整合到生殖細胞； （8）待雄性F1小鼠到8周齡，雌性F1小鼠到6周齡，進行相互配種，F2小鼠出生7天后PCR鑒定，確認純合子小鼠的出生； （9）將COL7A1純合子小鼠進行表型分析，觀察小鼠皮膚表征； （10）構建打靶載體III,在打靶載體II的基礎上引入突變c.6527dupC； （11）將構建好的打靶載體III電轉到陽性細胞細胞I中，細胞經過G418藥物篩選，挑取藥物抗性的ES克隆，相關ES克隆進行培養、擴增后進行PCR分型鑒定及Southern鑒定，獲得正確打靶的陽性ES細胞III； （12）將陽性ES細胞III注射入囊胚中，再將囊胚移植到代孕鼠內，通過20天左右的孕期，小鼠出生； （13）剪取5-7d的幼鼠鼠爪，提取DNA，進行PCR分型鑒定確認小鼠基因型； （14）待雄性Founder小鼠到8周齡與野生型異性小鼠交配獲得F1代雜合子小鼠，小鼠出生7天后PCR鑒定，若有陽性小鼠出生，則表示轉基因已經整合到生殖細胞； （15）待雄性F1小鼠到8周齡，雌性F1小鼠到6周齡，進行相互配種，F2小鼠出生7天后PCR鑒定，確認純合子小鼠的出生； （16）將hCOL7A1c.6527dupC小鼠純合子小鼠進行表型分析，觀察小鼠皮膚表征。

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