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龍圖騰網(wǎng)獲悉上海交通大學(xué)申請(qǐng)的專(zhuān)利一種精準(zhǔn)分析單細(xì)胞APA位點(diǎn)的sc3T-seq方法獲國(guó)家發(fā)明授權(quán)專(zhuān)利權(quán)，本發(fā)明授權(quán)專(zhuān)利權(quán)由國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局授予，授權(quán)公告號(hào)為：CN116083531B 。

龍圖騰網(wǎng)通過(guò)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局官網(wǎng)在2025-08-26發(fā)布的發(fā)明授權(quán)授權(quán)公告中獲悉：該發(fā)明授權(quán)的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?專(zhuān)利號(hào)為：202310082830.2，技術(shù)領(lǐng)域涉及：C12Q1/6806；該發(fā)明授權(quán)一種精準(zhǔn)分析單細(xì)胞APA位點(diǎn)的sc3T-seq方法是由康亞妮;文柏清;張偉偉;張飛;何夢(mèng)菊;張博涵設(shè)計(jì)研發(fā)完成，并于2023-01-18向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交的專(zhuān)利申請(qǐng)。

本一種精準(zhǔn)分析單細(xì)胞APA位點(diǎn)的sc3T-seq方法在說(shuō)明書(shū)摘要公布了：本發(fā)明公開(kāi)了一種精準(zhǔn)分析單細(xì)胞APA位點(diǎn)的sc3T?seq方法，涉及分子生物學(xué)和生物信息學(xué)領(lǐng)域，oligodT20引物與鏈霉親和素的磁珠孵育結(jié)合，加入少量起始樣本和外源單鏈DNA，雙鏈cDNA合成，雙鏈cDNA斷裂，移除polyA，釋放帶標(biāo)簽的cDNA，加入具有生物素標(biāo)記的λ?DNA，加入羧基磁珠，篩選去除外源cDNA，末端修復(fù)、加接頭、構(gòu)建cDNA文庫(kù)，鏈霉素親和磁珠去除生物素標(biāo)記λDNA，得到純凈的樣本文庫(kù)。本發(fā)明降低了起始樣品量，使分析APA位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)能夠適用于少量樣本甚至單個(gè)細(xì)胞，對(duì)于精準(zhǔn)檢測(cè)、分析細(xì)胞特異性的APA有很大的作用。

本發(fā)明授權(quán)一種精準(zhǔn)分析單細(xì)胞APA位點(diǎn)的sc3T-seq方法在權(quán)利要求書(shū)中公布了：1.一種精準(zhǔn)分析單細(xì)胞APA位點(diǎn)的sc3T-seq方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 步驟1、磁珠與引物探針結(jié)合制備GsuⅠ-OligodT20磁珠；設(shè)計(jì)并合成一種外源單鏈DNA片段，加入樣本中，再加至制備好的所述GsuⅠ-OligodT20磁珠中，mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA； 步驟2、將配置好的二鏈合成體系與重懸好的步驟1得到的第一鏈cDNA進(jìn)行合成反應(yīng)，合成第二鏈cDNA，得到雙鏈cDNA； 步驟3、片段化酶反應(yīng)體系重懸步驟2得到的雙鏈cDNA，置于冰上5min后加入5μL雙鏈DNA片段化酶NEB，進(jìn)行片段化反應(yīng)，隨機(jī)斷裂新合成的所述雙鏈cDNA，得到斷裂后的cDNA； 步驟4、將配制好的消化反應(yīng)體系加至裝有步驟3得到的斷裂后的cDNA的離心管中將其重懸，進(jìn)行酶切反應(yīng)，3'UTR末端從所述GsuⅠ-OligodT20磁珠上釋放得到3'端標(biāo)簽原始文庫(kù)； 步驟5、將步驟4得到的3'端標(biāo)簽原始文庫(kù)中加入外源λDNA，純化所述cDNA片段并去除所述外源單鏈DNA片段得到DNA標(biāo)簽文庫(kù)； 步驟6、將步驟5得到的DNA標(biāo)簽文庫(kù)末端修復(fù)得到末端修飾后的DNA，將所述末端修飾后的DNA的3’末端加A尾，與高通量測(cè)序接頭連接、高保真酶的PCR放大以及文庫(kù)片段篩選，建庫(kù)完成后，除去生物素標(biāo)記的λ-DNA、純化體系，得到無(wú)外源DNA污染的文庫(kù)；所述引物探針的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示； 所述步驟1中所述外源單鏈DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示； 所述步驟2中所述二鏈合成體系的組分為：30μL洗劑1，184μL無(wú)酶水，25μL10×二鏈合成緩沖液，5μL10mM的dNTP，所述dNTP是由100mmolL的dATPdGTPdCTPdUTP按照相應(yīng)的比例混合得到，1μLDNA連接酶，4μLDNA聚合酶，1μL核糖核酸酶H；其中所述洗劑1的組分為：280μL無(wú)酶水，80μL5×一鏈合成緩沖液，40μL0.1M的二硫蘇糖醇；所述步驟3中所述片段化酶反應(yīng)體系的組分為：水39.5μL，10×片段酶反應(yīng)緩沖液5μL，100×牛血清白蛋白0.5μL，配套的斷裂酶5μL； 所述步驟4中所述消化反應(yīng)體系的組分為：10×bufferB10μL，0.5mmolLS-腺苷甲硫氨酸2μL，GsuⅠ2μL，雙蒸水86μL；其中所述bufferB為GsuⅠ配套的緩沖液，所述GsuⅠ的濃度為5UL；所述步驟5中加入所述外源λDNA的質(zhì)量為100ng；使用0.9x的磁珠去除所述外源單鏈DNA片段； 所述步驟6中使用鏈霉素磁珠除去所述生物素標(biāo)記的λ-DNA。

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